РЕПЛИКАЦИЯ

Cell Biology.ru

Репликацию ДНК удобнее всего рассматривать на бактерии E.coli, как на наиболее изученном прокариотическом организме.
Направление движения вилки репликации

Репликация происходит одновременно в двух направлениях от места начала репликации. Обе цепи синтезируются холоэнзим ДНК-полимеразой III.

Одна из альфа субъединиц холоэнзима синтезирует лидирующую, тогда как другая альфа субъединица синтезирует отстающие цепи, называемые фрагментами Оказаки, имеющие 10 РНК нуклеотидов на 5' конце (РНК-праймер) и около 1000 нуклеотидов ДНК.

РНК-праймер удаляется ДНК-полимеразой I и фрагменты сшиваются друг с другом ДНК лигазой.

ДНК-полимеразы E.coil

У E.coli имеется пять различных ДНК-полимераз.

Pol I

pol I представлена одним полипептидом с тремя активностями:

• полимеразная — катализирует перенос нуклеотидов к 3'-концу праймера ДНК или РНК и спаривание комплементарного нуклеотида
• 3'-5'-экзонуклеазная — удаляет 3'-концевые ошибочно встроенные нуклеотиды, препятствуя образованию мутаций
• 5'-3'-экзонуклеазная — удаляет 5'-концевые нуклеотиды

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстаю- щей цепи.

Pol I удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи.

Поскольку Pol I способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией).

этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК

Трипсин расщепляет Pol I на два фрагмента: большой C-концевой «фрагмент Кленова» (ДНК-полимераза, 3'-5'-экзонуклеаза) и малый N-концевой (5'-3'-экзонуклеаза).

Pol II

Pol II присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Pol I, и не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью. Следовательно, Pol II может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не спо- собна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. присутствуют в клетке в меньших количествах.

Pol III

Pol III-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli.

В каждой клетке содержится только 10–20 копий Pol III-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, Но поскольку Pol III-xoлофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие Pol I, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.?-субъединица обладает полимеразной активностью, а ?-субъединица -3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс ?- и ?-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, ?-субъединицы пока неясна.Помимо субъединиц, составляющих Pol III-кор, Pol III-холофермент содержит еще семь субъединиц: ?, ?, ?, ?, ?', ? и ?. Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате молекулярная масса комплекса составляет примерно 103 кДа. Роль ?-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна.Pol III-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой отстающей.Pol III-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и Pol I, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, Pol III-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования.

Pol III-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации.

На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (расплетазы или геликазы), инициирующие образование праймерных РНК праймазы), обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК

Терминация ДНК-репликации

Окончание репликации ter (terminus) находятся на противоположной стороне от ориджина кольцевой хромосомы E. coli. Ter сайты работают как ловушки: репликационная вилка попадает и не выходит из этой области в 450 тысяч пн. Имеется 6 ter сайтов терминации.

Белок Tus связывается с ter сайтами и останавливает гиликазу DnaB. Синтез ведущей цепи ДНК останавливается в 1 нуклеотиде от места связывания белка Tus. Ter сайты работают только в одном направлении. Для каждого раунда репликации, только один сайт терминации обычно используется.

Остановившаяся на сайте терминации вилка ждет другую вилку, которая придет с другой стороны.

Расхождение дочерних кольцевых молекул ДНК

Для разделения дочерних кольцевых молекул ДНК требуется действие топоизомераз. Топоизомераза IV (parC и parD) выполняет эту функцию. Работает совместно с топоизомеразой II (gyrase, gyrA и gyrB).

Репликация ДНК — Науколандия

• Механизм репликации ДНК
• Ферменты, участвующие в репликации

Репликация ДНК — это процесс ее удвоения перед делением клетки. Иногда говорят «редупликация ДНК». Удвоение происходит в S-фазе интерфазы клеточного цикла.

Очевидно, самокопирование генетического материала в живой природе есть необходимость. Только так дочерние образующихся при делении клетки могут содержать столько же ДНК, сколько его изначально было в исходной. Благодаря репликации все генетически запрограммированные особенности строения и метаболизма передаются в ряду поколений.

В процессе деления клетки каждая молекула ДНК из пары идентичных отходит в свою дочернюю клетку. Таким образом обеспечивается точная передача наследственной информации.

При синтезе ДНК потребляется энергия, т. е. это энергозатратный процесс.

Механизм репликации ДНК

Молекула ДНК сама по себе (без удвоения) представляет собой двойную спираль. В процессе редупликации водородные связи между двумя ее комплементарными цепями разрываются. И на каждой отдельной цепи, которая теперь служит шаблоном-матрицей, строится новая комплиментарная ей цепь.

Таким образом образуются две молекулы ДНК. У каждой одна цепь достается ей от материнской ДНК, вторая — вновь синтезированная. Поэтому механизм репликации ДНК является полуконсервативным (одна цепь старая, одна новая). Такой механизм репликации был доказан в 1958 году.

В молекуле ДНК цепи антипараллельны. Это значит, что одна нить идет в направлении от 5' конца к 3', а комплементарная ей — наоборот. Цифры 5 и 3 обозначают номера атомов углерода в дезоксирибозе, входящей в состав каждого нуклеотида.

Для наглядности можно представить, что вы положили руку на руку, как первоклашка, сидящий за партой.

Основной фермент, который выполняет наращивание новой нити ДНК, способен делать это только в одном направлении. А именно: присоединять новый нуклеотид только к 3' концу. Таким образом, синтез может идти только в направлении от 5' к 3'.

Цепи антипараллельны, значит синтез должен идти на них в разных направлениях. Если бы цепи ДНК сначала полностью расходились, а потом на них уже строилась новая комплементарная, то это не было бы проблемой. В действительности же цепи расходятся в определенных точках начала репликации, и в этих местах на матрицах сразу начинается синтез.

Формируются так называемые репликационные вилки. При этом на одной материнской цепи синтез идет в сторону расхождения вилки, и этот синтез происходить непрерывно, без разрывов.

На второй матрице синтез идет в обратную сторону от направления расхождения цепей исходной ДНК. Поэтому такой обратный синтез может идти только кусками, которые называются фрагментами Оказаки.

Позже такие фрагменты «сшиваются» между собой.

Дочерняя цепь, которая реплицируется непрерывно, называется лидирующей, или ведущей. Та, которая синтезируется через фрагменты Оказаки, — запаздывающей, или отстающей, так как фрагментарная репликация выполняется медленнее.

На схеме нити родительской ДНК постепенно расходятся в направлении, в котором идет синтез ведущей дочерней цепи. Синтез отстающей цепи идет в обратную расхождению сторону, поэтому вынужден выполняться кусками.

Другой особенностью основного фермента синтеза ДНК (полимеразы) является то, что он не может сам начать синтез, только продолжить. Ему необходима затравка, или праймер. Поэтому на родительской нити сначала синтезируется небольшой комплементарный участок РНК, потом уже происходит наращивание цепи с помощью полимеразы. Позже праймеры удаляются, дыры застраиваются.

На схеме затравки показаны только на отстающей цепи. На самом деле они есть и на лидирующей. Однако здесь нужен только один праймер на вилку.

Поскольку цепи материнской ДНК не всегда расходятся с концов, а в точках инициализации, то на самом деле формируются не столько вилки, сколько глазки, или пузыри.

ДНК прокариот не линейна, а имеет кольцевую структуру и лишь одну точку начала репликации.

На схеме красным и синим цветом показаны две нити родительской молекулы ДНК. Новые синтезирующиеся нити показаны пунктиром.

У прокариот самокопирование ДНК выполняется быстрее, чем у эукариот. Если скорость редупликации у эукариот составляет сотни нуклеотидов в секунду, то у прокариот достигает тысячи и более.

Ферменты репликации

Репликацию ДНК обеспечивает целый комплекс ферментов, который называется реплисомой. Всего ферментов и белков репликации более 15. Ниже перечислены наиболее значимые.

Основным ферментом репликации является уже упомянутая ДНК-полимераза (на самом деле существует несколько разных), которая непосредственно осуществляет наращивание цепи. Это не единственная функция фермента.

Полимераза способна «проверять», какой нуклеотид пытается присоединиться к концу. Если неподходящий, то она его удаляет. Другими словами, частичная репарация ДНК, т. е.

ее исправление ошибок репликации, происходит уже на этапе синтеза.

Нуклеотиды, находящиеся в нуклеоплазме (или цитоплазме у бактерий), существуют в форме трифосфатов, т. е. это не нуклеотиды, а дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ).

Они похожи на АТФ, у которой три фосфатных остатка, два из которых связаны макроэргической связью. При разрыве таких связей выделяется много энергии. Также и у дезоксинуклеозидтрифосфатов две связи макроэргические.

Полимераза отделяет два последних фосфата и использует выделяющуюся энергию на реакцию полимеризации ДНК.

Поскольку молекула ДНК представляет собой двойную спираль, то разрыв связей провоцирует еще большее ее скручивание. Представьте канат из двух закрученных относительно друг друга веревок, и вы с одной стороны за концы тянете одну вправо, другую — влево. Сплетенная часть станет еще больше скручиваться, будет более тугой.

Для устранения подобного напряжения необходимо, чтобы еще неразошедшаяся двойная спираль быстро крутилась вокруг своей оси, «сбрасывая» возникающую сверхспирализацию. Однако это слишком энергозатратно.

Поэтому в клетках реализуется другой механизм. Фермент топоизомераза разрывает одну из нитей, пропускает через разрыв второю и снова сшивает первую. Чем и устраняются возникающие супервитки.

Разошедшиеся в результате действия хеликазы нити матричной ДНК пытаются опять соединиться своими водородными связями. Чтобы этого не произошло, в действие вступают ДНК-связывающие белки. Это не ферменты в том понимании, что реакций они не катализируют. Такие белки прикрепляются к нити ДНК на всем ее протяжении и не дают комплементарным цепям матричной ДНК сомкнуться.

Праймеры синтезируются РНК-праймазой. А удаляются экзонуклеазой. После удаления праймера «дыру» застраивает другой тип полимеразы. Однако при этом отдельные участки ДНК не сшиваются.

Отдельные части синтезируемой цепи сшиваются таким ферментом репликации как ДНК-лигаза.

Репликация в биологии — это важный молекулярный процесс клеток организма

Нуклеиновые кислоты играют большую роль в обеспечении жизнедеятельности клеток живых организмов. Важным представителем этой группы органических соединений является ДНК, которая несет всю генетическую информацию и отвечает за проявление необходимых признаков.

Что такое репликация?

В процессе деления клеткам необходимо увеличить количество нуклеиновых кислот в ядре, чтобы не произошла потеря генетической информации в процессе. В биологии репликация – это удвоение ДНК путем синтеза новых цепей.

Основная цель этого процесса заключается в передаче генетической информации дочерним клеткам в неизменном виде без каких-либо мутаций.

Ферменты и белки репликации

Удвоение молекулы ДНК можно сравнить с любым метаболическим процессом в клетке, для которого необходимы соответствующие белки. Так как в биологии репликация – это важная составляющая клеточного деления, соответственно, немало вспомогательных пептидов здесь участвуют.

• ДНК-полимераза — важнейший фермент редупликации, который отвечает за синтез дочерней цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты. В цитоплазме клетки в процессе репликации обязательно присутствие нуклеиновых трифосфатов, которые приносят все нуклеиновые основания.

Эти основания являются мономерами нуклеиновой кислоты, поэтому из них строится вся цепочка молекулы. ДНК-полимераза отвечает за процесс сборки в правильном порядке, иначе неизбежно появление всевозможных мутаций.

• Праймаза — белок, который отвечает за формирование затравки на матричной цепи ДНК. Эта затравка называется также праймер, она имеет строение РНК. Для фермента ДНК-полимераза важно наличие начальных мономеров, с которых возможен дальнейший синтез всей полинуклеотидной цепочки. Эту функцию выполняет праймер и соответствующий ему фермент.
• Хеликаза (геликаза) формирует репликационную вилку, которая представляет собой расхождение матричных цепей путем разрыва водородных связей. Так полимеразам проще подойти к молекуле и начать синтез.
• Топоизомераза. Если представить молекулу ДНК в виде закрученной веревки, при продвижении полимеразы по цепи будет формироваться положительное напряжение из-за сильного скручивания. Эту проблему решает топоизомераза – фермент, который на короткое время разрывает цепочку и разворачивает при этом всю молекулу. После чего поврежденное место сшивается вновь, а ДНК не испытывает напряжения.
• Ssb-белки, как грозди, присоединяются к цепям ДНК в репликационной вилке, чтобы предупредить повторное формирование водородных связей раньше окончания процесса редупликации.
• Лигаза. Функция фермента заключается в сшивании фрагментов Оказаки на отстающей цепи молекулы ДНК. Происходит это путем вырезания праймеров и встраивания на их месте нативных мономеров дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В биологии репликация – это сложный многоступенчатый процесс, который предельно важен при делении клеток. Поэтому использование различных белков и ферментов необходимо для эффективного и правильного синтеза.

Существует 3 теории, которые объясняют процесс удвоения ДНК:

1. Консервативная утверждает, что одна дочерняя молекула нуклеиновой кислоты имеет матричную природу, а вторая полностью синтезирована с нуля.
2. Полуконсервативная предложена Уотсоном и Криком и подтверждена в 1957 году в опытах на E. Coli. Эта теория гласит, что обе дочерние молекулы ДНК имеют одну старую цепочку и одну новосинтезированную.
3. Дисперсивный механизм основан на теории о том, что дочерние молекулы имеют по всей длине чередующиеся участки, состоящие как из старых, так и из новых мономеров.

Сейчас научно доказана полуконсервативная модель. Что такое репликация на молекулярном уровне? В начале хеликаза разрывает водородные связи молекулы ДНК, открывая тем самым обе цепи для фермента полимеразы. Последние после формирования затравок начинают синтез новых цепей в направлении 5’-3’.

Свойство антипараллельности ДНК является основной причиной формирования, лидирующей и отстающей цепей. На лидирующей цепи ДНК-полимераза движется беспрерывно, а на отстающей она формирует фрагменты Оказаки, которые в будущем будут соединены с помощью лигазы.

Особенности репликации

Сколько молекул ДНК в ядре после репликации? Сам процесс подразумевает удвоение генетического набора клетки, поэтому в синтетический период митоза диплоидный набор имеет в два раза больше молекул ДНК. Такая запись обычно помечается как 2n 4c.

Кроме биологического смысла репликации ученые нашли применение процесса в различных сферах медицины и науки. Если в биологии репликация – это удвоение ДНК, то в лабораторных условиях размножение молекул нуклеиновой кислоты используется для создания нескольких тысяч копий.

Такой метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Механизм этого процесса схож с репликацией in vivo, поэтому для его протекания применяются аналогичные ферменты и буферные системы.

Выводы

Репликация имеет важное биологическое значение для живых организмов. Передача генетической информации при делении клеток не обходится без удвоения молекул ДНК, поэтому на всех этапах важна слаженная работа ферментов.