Жидкостная хроматография
Жидкостная (или жидкофазная) хроматография — это целая группа методов разделения, в которых происходит распределение соединений между подвижной жидкой фазой и стационарной фазой с большой удельной поверхностью, над которой перемещается жидкая фаза. Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
ВЭЖХ приобретает в последнее время все более широкое применение. Она используется в дополнение к газовой хроматографии и имеет особо важное значение
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) приобретает в последнее время псе большее значение как методика разделения различных смесей, особенно в фармацевтической и пищевой промышленности.
для определения нелетучих соединений. ВЭЖХ используется, например, для быстрого обнаружения различных добавок, загрязнений и естественных компонентов в пищевых продуктах.
Большая удельная поверхность и, следовательно, высокая эффективность разделения в хроматографической колонке достигаются в результате использования микрозернистых твердых носителей, однородных по размерам зерна. Однако колонки, наполненные такими микрозернистыми твердыми носителями, оказывают большое сопротивление потоку жидкости.
Поэтому для пропускания через них подвижной жидкой фазы требуются высокие давления. По этой причине ВЭЖХ называется также жидкостной хроматографией высокого давления.
[attention type=yellow]Основным оборудованием лаборатории является рабочий стол, на котором проводится вся экспериментальная работа.
[/attention]В каждой лаборатории должна быть хорошая вентиляция. Обязателен вытяжной шкаф, в котором проводят все работы с использованием дурно пахнущих или ядовитых соединений, а также сжигание в тиглях органических веществ.
В специальном вытяжном шкафу, в котором не проводят работ, связанных с нагреванием, хранят легколетучие, вредные или дурно пахнущие вещества (жидкий бром, концентрированные азотную и соляную кислоты и т. п.
), а также легковоспламеняющиеся вещества (сероуглерод, эфир, бензол и др.).
В лаборатории необходимы водопровод, канализация, проводка технического тока, газа и водонагрева-тельные приборы. Желательно также иметь подводку сжатого воздуха, вакуум-линию, подводку горячей воды и пара.
Если пет специальной подводки, для получения горячей воды применяют водонагреватели различных систем.
При помощи этих аппаратов, обогреваемых электричеством или газом, можно быстро получить струю горячей воды с температурой почти 100° С.
Лаборатория должна иметь установки для дистилляции (или деминерализации) воды, так как без дистиллированной или деминерализованной воды в лаборатории работать нельзя. В тех случаях, когда получение дистиллированной воды затруднено или невозможно, пользуются продажной дистиллированной водой
Около рабочих столов и водопроводных раковин обязательно должны быть глиняные банки емкостью 10-— 15 л для сливания ненужных растворов, реактивов и т. д., а также корзины для битого стекла, бумаги и прочего сухого мусора.
Кроме рабочих столов, в лаборатории должны быть письменный стол, где хранятся все тетради и записи, и, при необходимости, титровальный стол. Около рабочих столов должны быть высокие табуреты или стулья.
[attention type=red]Аналитические весы и приборы, требующие стационарной установки (электрометрические, оптические и др.), помещают в отдельном, связанном с лабораторией помещении, причем для аналитических весов должна быть выделена специальная весовая комната. Желательно, чтобы весовая была расположена окнами на север. Это важно потому, что на весы не должен попадать солнечный свет («Весы и взвешивание»).
[/attention]В лаборатории нужно иметь также самые необходимые справочные книги, пособия и учебники, так как нередко во время работы возникает необходимость в тон или иной справке.
К оглавлению
см. также
Page 3
Применяемая в лабораториях химическая посуда может быть разделена на ряд групп. По назначению посуду можно разделить на посуду общего назначения, специального назначения и мерную. По материалу — на посуду из простого стекла, специального стекла, из кварца.
К группе. общего назначения относятся те предметы, которые всегда должны быть в лабораторий и без которых нельзя провести большинство работ. Такими являются: пробирки, воронки простые и делительные, стаканы, плоскодонные колбы, кристаллизаторы, конические колбы (Эрленмейера), колбы Бунзена, холодильники, реторты, колбы для дистиллированной воды, тройники, краны.
К группе специального назначения относятся те предметы, которые употребляются для одной какой-либо цели, например: аппарат Киппа, аппарат Сок-слета, прибор Кьельдаля, дефлегматоры, склянки Вуль-фа, склянки Тищенко, пикнометры, ареометры, склянки Дрекселя, кали-аппараты, прибор для определения двуокиси углерода, круглодонные колбы, специальные холодильники, прибор для определения молекулярного веса, приборы для определения температуры плавления и кипения и др.
К мерной посуде относятся: мерные цилиндры и мензурки, пипетки, бюретки и мерные колбы.
Для начала предлагаем посмотреть следующий видеоролик, где кратко и доступно рассмотрены основные виды химической посуды.
см. также:
Посуда общего назначения
Пробирки (рис. 18) представляют собой узкие цилиндрической формы сосуды с закругленным дном; они бывают различной величины и диаметра и из различного стекла. Обычные» лабораторные пробирки изготовляют из легкоплавкого стекла, но для особых работ, когда требуется нагревание до высоких температур, пробирки изготовляют из тугоплавкого стекла или кварца.
Кроме обычных, простых пробирок, применяют также градуированные и центрифужные конические пробирки.
[attention type=green]Для хранения пробирок, находящихся в работе, служат специальные деревянные, пластмассовые или металлические штативы (рис. 19).
[/attention]Рис. 18. Простая и градуированная пробирки
Рис. 20. Внесение в пробирку бирки порошкообразных веществ.
Пробирки применяют для проведения главным образом аналитических или микрохимических работ. При проведении реакций в пробирке реактивы не следует применять в слишком большом количестве. Совершенно недопустимо, чтобы пробирка была наполнена до краев.
Реакцию проводят с небольшими количествами веществ; достаточно бывает 1/4 или даже 1/8 емкости пробирки. Иногда в пробирку нужно ввести твердое вещество (порошки, кристаллы и т. п.
), для этого полоску бумаги шириной чуть меньше диаметра пробирки складывают вдвое по длине и в полученный совочек насыпают нужное количество твердого вещества. Пробирку держат в левой руке, наклонив ее горизонтально, и вводят в нее совочек почти до дна (рис. 20).
Затем пробирку ставят вертикаль» но и слегка ударяют по ней. Когда все твердое вещество высыпется, бумажный совочек вынимают.
Для перемешивания налитых реактивов пробирку держат большим и указательным пальцами левой руки за верхний конец и поддерживают ее средним пальцем, а указательным пальцем правой руки ударяют косым ударом по низу пробирки. Этого достаточно, чтобы содержимое ее было хорошо перемешано.
Совершенно недопустимо закрывать пробирку пальцем и встряхивать ее в таком виде; при этом можно не только ввести что-либо постороннее в жидкость, находящуюся в пробирке, но иногда и повредить кожу пальца, получить ожог и пр.
Если Пробирка наполнена жидкостью больше чем на половину, содержимое перемешивают стеклянной палочкой.
Если пробирку нужно нагреть, ее следует зажать в держателе.
При неумелом и сильном нагревании пробирки жидкость быстро вскипает и выплескивается из нее, поэтому нагревать нужно осторожно-Когда начнут появляться пузырьки, пробирку следует отставить и, держа ее не в пламени горелки, а около него или над ним, продолжать нагревание горячим воздухом. При нагревании открытый конец пробирки должен быть обращен в сторону от работающего и от соседей по столу.
Когда не требуется сильного нагрева, пробирку с нагреваемой жидкостью лучше опустить в горячую воду. Если работают с маленькими пробирками (для полумикроанализа), то нагревают их только в горячей воде, налитой в стеклянный стакан соответствующего размера (емкостью не больше 100 мл).
Воронки служат для переливания — жидкостей, для фильтрования и т. д. Химические воронки выпускают различных размеров, верхний диаметр их составляет 35, 55, 70, 100, 150, 200, 250 и 300 мм.
Обычные воронки имеют ровную внутреннюю стенку, но для ускоренного фильтрования иногда применяют воронки с ребристой внутренней поверхностью.
Воронки для фильтрования всегда имеют угол 60° и срезанный длинный конец.
При работе воронки устанавливают или в специальном штативе, или в кольце на обычном лабораторном штативе (рис. 21).
[attention type=yellow]Для фильтрования в стакан полезно сделать простой держатель для воронки (рис.22).Для этого из листового алюминия толщиной около 2 мм вырезают полоску длиной 70—80 лш и шириной 20 мм.
[/attention]На одном из концов полоски просверливают отверстие диаметром 12—13 мм и полоску сгибают так, как показано на рис. 22, а. Как укрепить воронку на стакане, показано на рис. 22, б.
При переливании жидкости в бутыль или колбу не следует наполнять воронку до краев.
Если воронка плотно прилегает к горлу сосуда, в который переливают жидкость, то переливание затрудняется, так как внутри сосуда создается повышенное давление. Поэтому воронку время от времени нужно приподнимать.
Еще лучше сделать между воронкой и горлом сосуда щель, вложив между ними, например, кусочек бумаги. При этом нужно следить, чтобы прокладка не попала в сосуд. Целесообразнее применять проволочный треугольник, который можно сделать самому.
Этот треугольник помещают на горло сосуда и затем вставляют воронку.
Существуют специальные резиновые или пластмассовые насадки на горлышко посуды, которые обеспечивают сообщение внутренней части колбы с наружной атмосферой (рис. 23).
Рис. 21. Укрепление стекляниой химической воронки
Рис. 22. Приспособление для крепле- ния воронки на стакане, в штативе.
Для аналитических работ при фильтровании лучше пользоваться аналитическими воронками (рис. 24). Особенность этих воронок заключается в том, что они имеют удлиненный срезанный конец, внутренний диаметр которого в верхней части меньше, чем в нижней части; такая конструкция ускоряет фильтрование.
Кроме того, бывают аналитические воронки с ребристой внутренней поверхностью, поддерживающей фильтр, и с шарообразным расширением в месте перехода воронки в трубку. Воронки такой конструкции ускоряют процесс фильтрования почти в три раза по сравнению с обычными воронками.
Рис. 23. Насадки на горла бутылей. Рис. 24. Аналитическая воронка.
Делительные воронки (рис. 25) применяют для разделения несмешивающихся жидкостей (например, воды и масла). Они имеют или цилиндрическую, или грушевидную форму и в большинстве случаев снабжены притертой стеклянной пробкой.
[attention type=red]В верхней части отводной трубки находится стеклянный притертый кран. Емкость делительных воронок различна (от 50 мл и до нескольких литров), в зависимости от емкости меняется и толщина стенок.
[/attention]Чем меньше емкость воронки, тем тоньше ее стенки, и наоборот.
При работе делительные воронки в зависимости от емкости и формы укрепляют по-разному. Цилиндрическую воронку небольшой емкости можно укрепить просто в лапке. Большие же воронки помещают между двумя кольцами.
Нижняя часть цилиндрической воронки должна опираться на кольцо, диаметр которого немного меньше диаметра воронки, верхнее кольцо имеет диаметр несколько больший.
Если воронка при этом качается, между кольцом и воронкой следует положить пластинку из пробки.
Грушевидную делительную воронку укрепляют на кольце, горлышко ее зажимают лапкой. Всегда прежде закрепляют воронку, а уже потом наливают в нее подлежащие разделению жидкости.
Капельные воронки (рис. 26) отличаются от делительных тем, что они более легкие, тонкостенные и
Рис. 25. Делительные воронки. рис. 26. Капельные воронки.
B большинстве случаев с длинным концом. Эти воронки врименяют при многих работах, когда вещество добавляют в реакционную массу небольшими порциями или по каплям. Поэтому они обычно составляют часть прибора. Воронки укрепляют в горле колбы на шлифе или при помощи корковой либо резиновой пробки.
Перед работой с делительной или капельной воронкой шлиф стеклянного крана нужно осторожно смазать вазелином или специальной смазкой.
[attention type=green]Это дает возможность открывать кран легко и без усилий, что очень важно, так как если кран открывается туго, то можно при открывании сломать его или повредить весь прибор.
[/attention]Смазку нужно наносить очень тонким слоем так, чтобы при поворачиваиии крана она не попадала в трубку воронки или внутрь отверстия крана.
Для более равномерного стекания капель жидкости из капельной воронки и для наблюдения за скоростью подачи жидкости применяют капельные воронки с насадкой (рис. 27). У таких воронок сразу после крана находится расширенная часть, переходящая в трубку. Жидкость через кран поступает в это расширение по короткой трубке и затем в трубку воронки.
Рис. 27. Kaпельная воронка с насадкой
Рис. 28. Химические стаканы.
Рис. 29. Плоскопельная воронка с насадкой
СТЕКЛЯННАЯ ПОСУДА 1 2 3
К оглавлению
см. также
ЖИ́ДКОСТНА́Я ХРОМАТОГРА́ФИЯ
Авторы: Я. И. Яшин
ЖИ́ДКОСТНА́Я ХРОМАТОГРА́ФИЯ, метод разделения, идентификации, количественного определения и физико-химич. исследования веществ; вид хроматографии, в которой в качестве подвижной фазы (элюента) используется жидкость.
Историческая справка
Хроматография открыта М. С. Цветом в 1903 в виде колоночного жидкостно-адсорбционного метода. Более полувека практич. применение метода было ограничено препаративным выделением веществ в чистом виде ионообменными процессами разделения редкоземельных и трансурановых элементов. Для аналитич.
целей метод не использовался в связи с длительностью (до нескольких часов) эксперимента, которая была обусловлена несколькими факторами (применением адсорбентов с размером зёрен более 50–100 мкм, прохождением элюента через колонку под действием только силы тяжести, отсутствием проточных детекторов).
Экспрессная аналитич. Ж. х. создана в 1960–70-х гг., причём ускорение массообмена между подвижной и неподвижной фазами – увеличение скорости разделения – было достигнуто за счёт уменьшения диаметра зёрен адсорбентов.
Использование мелких (5–10 мкм) зёрен потребовало, из-за возникшего большого входного давления, применения насосов высокого давления и привело к разработке Ж. х. высокого давления. Эффективность колонок при переходе к мелким фракциям адсорбента существенно возросла (в расчёте на единицу длины в неск.
сотен раз превысила эффективность колонок в газовой хроматографии), поэтому совр. экспрессную аналитич. Ж. х. с использованием жёстких адсорбентов мелкого зернения, насосов высокого (св. 20 МПа) давления и проточных детекторов называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
По временам разделения ВЭЖХ не уступает газовой хроматографии, по областям применения значительно её превосходит.
Основные методы
Предложено неск. десятков методов и вариантов Ж. х., которые позволяют разделять смеси соединений с молекулярными массами от 50 до нескольких млн., включая изомеры (в т. ч. оптические), макромолекулы синтетических и биополимеров, ионы, стабильные радикалы, вирусы и др. микрочастицы.
По механизму разделения выделяют следующие осн. методы Ж. х.: адсорбционный – разделение происходит за счёт разл. адсорбируемости компонентов смеси на поверхности твёрдого тела (адсорбента); распределительный – разделение за счёт разл.
растворимости в плёнке жидкой фазы, нанесённой на поверхность твёрдого носителя; ионообменный (ионный, ион-парный) – за счёт разл. способности разделяемых ионов в растворе к ионному обмену с ионитом – неподвижной фазой (см. в ст.
[attention type=yellow]Ионообменная хроматография); эксклюзионный (молекулярно-ситовый, гель-фильтрационный, гель-проникающий) – разделение макромолекул полимеров, а также малых молекул и ионов за счёт разл. размеров или формы и способности проникать в поры неионогенного геля – неподвижной фазы (см. в ст.
[/attention]Эксклюзионная хроматография); аффинный (биоспецифический) – разделение биологически активных соединений за счёт биоспецифич. взаимодействий с комплементарными сорбционными центрами неподвижной фазы (см. в ст. Аффинная хроматография); лигандообменный – разделение за счёт разл.
способности разделяемых соединений к комплексообразованию с катионами металлов или функциональными группами неподвижной фазы; хиральный (энантиоселективный) – разделение энантиомеров за счёт взаимодействия с хиральными группами неподвижной или подвижной фазы, а также ряд др. методов. К совр.
методам относятся противоточная, мембранная, высокотемпературная, циркуляционная, многомерная и др. варианты жидкостной хроматографии.
Основные параметры
Измеряемые величины, характеризующие Ж. х., следующие: параметры удерживания (время удерживания $t_ ext{R}$, объём удерживания $V_ ext{R}$ и фактор удерживания), эффективность колонки (число теоретич.
тарелок $N$ или высота, эквивалентная одной теоретич. тарелке, $H$), селективность разделения (коэф.
селективности $α$ – отношение времени удерживания двух соседних пиков на хроматограмме), степень разделения (отношение разности удерживания двух соседних пиков к сумме полуширин этих пиков, $R$).
На разделение влияет темп-ра, расход и природа подвижной фазы. В зависимости от природы подвижной фазы меняется её элюирующая способность. В Ж. х.
применяют изократический режим элюирования (подвижной фазой с постоянной элюирующей способностью) и градиентный (подвижной фазой с увеличивающейся во времени элюирующей способностью).
Селективность разделения связана с природой межмолекулярных взаимодействий сорбат – сорбент, сорбат – элюент, элюент – сорбент. В совр. вариантах Ж. х. учитывается влияние на характер этих взаимодействий геометрич. структуры (напр.
, при использовании сорбентов на основе циклодекстринов, жидких кристаллов, краун-эфиров), биологич. и химич. активности молекул, а также возможность разделения (в частности, полимеров) в критич.
условиях; осуществляется компьютерная оптимизация.
Проведение процесса
Жидкостные хроматографы состоят из ёмкости для элюента, насоса высокого давления (10–40 МПа), крана-дозатора, защитной и аналитич.
колонок, детектора, электронного блока детектора (блока питания, усилителя, аналого-цифрового преобразователя), термостатов колонки и ячейки детектора; для обработки информации используются компьютеры.
В ВЭЖХ применяется более 20 типов детектирующих систем; самые распространённые – спектрофотометрические, в т. ч. программируемые, с диодной матрицей (диапазон длин волн 200–900 нм), флуоресцентные, электрохимические, масс-спектрометрические, рефрактометрические, по светорассеянию.
[attention type=red]В медицине, биологии, фармацевтике (при расшифровке действующих начал экстрактов лекарственных растений) и в др. областях широко используются гибридные методы, сочетающие Ж. х. и масс-спектрометрию (с системой ввода пробы в спектрометр методом электрораспыления – электроспрей), ЯМР- или ИК-спектроскопию.
[/attention]Пределы обнаружения достигают 10–15–10–9 г.
https://www.youtube.com/watch?v=00im4xojcno
Для разделения компонентов используют аналитич. насадочные (внутр.
диаметр 2,0–4,6мм), микронасадочные (диаметр 0,5–1,0 мм), капиллярные (диаметр менее 0,05 мм; сорбционный слой иммобилизован на внутр.
стенках капилляра), а также препаративные колонки (диаметр более 10 мм). Длина насадочных колонок 5, 10, 15, 25 см. Размер зёрен сорбента 1–10 мкм (чаще всего сферич. частицы диаметром 5 мкм).
В зависимости от природы разделяемых соединений используют обращённо-фазовую хроматографию (ОФХ) или нормально-фазовую хроматографию (НФХ). В ОФХ сорбент (неподвижная фаза) менее полярен, чем подвижная фаза (элюент), в НФХ – более полярен.
В первом случае удерживание возрастает с ростом гидрофобности молекул разделяемой смеси, во втором – с ростом полярности молекул.
В ОФХ в качестве сорбентов используют силикагель с химически привитыми к поверхности алкильными цепями С1–С30 (чаще всего С8 или С18), в качестве элюентов – смеси метанол – вода, ацетонитрил – вода и др. с разным соотношением компонентов.
В НФХ в качестве сорбентов применяют пористый силикагель, силикагель с привитыми нитрильными и аминогруппами. В ОФХ и в НФХ применяют также полимерные и углеродные сорбенты.
Исходные пористые сорбенты обычно имеют удельную поверхность в пределах 100–400 м2/г, средний диаметр пор 8, 10, 20, 30 нм. При выборе сорбента оценивают эффективность, параметры удерживания, гидрофобность, стерическую селективность, способность образовывать водородные связи, ионообменную ёмкость и др. факторы.
[attention type=green]Разработаны технологии получения новых сорбентов и колонок для ВЭЖХ, в частности сорбентов для перфузионной хроматографии, монолитных колонок, пористых полимеров с порами молекулярных размеров, макропористых углеродных сорбентов.
[/attention]В перфузионных колонках микропотоки элюента проходят через открытые макропоры сорбента, что приводит к уменьшению размывания хроматографич. пиков по сравнению с обычными насадочными колонками. В монолитных колонках сплошной сорбционный слой создаётся непосредственно в колонке, напр.
в виде жёсткого пористого полимерного блока.
Области применения
ВЭЖХ используется в биологии и биотехнологии (в т. ч. при расшифровке генома человека, решении задач протеомики, пептидомики, метаболомики), в медицине (напр., для ранней диагностики заболеваний с использованием биохимич.
маркеров), в фармацевтике при создании новых лекарств и анализе их чистоты (в т. ч. энантиомерной), в судебно-мед. экспертизах, в контроле окружающей среды и пром. выбросов, технологич. процессов и качества продукции в химич., нефтехимич., пищевой, микробиологич. пром-сти.
Препаративную Ж. х. используют для выделения и очистки мн. природных и синтетич. веществ, в т. ч. биологически активных соединений, вирусов (гриппа, энцефалита и др.
), белков и полипептидов; в пром-сти – фуллеренов, инсулина, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмид ДНК, антибиотиков, оптич. изомеров и др.
