Бумажная хроматография

Бумажная хроматография

Бумажная хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сингом, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Мартин и Синг впоследствии были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии.

В последующие 10 лет этот метод получил огромное распространение, но с 1952 года бумажную хроматографию начал вытеснять новый метод тонкослойной хроматографии (являющийся по сути обобщением бумажной). Последний оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения.

Поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

Классификация[ | ]

Бумажную хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на препаративную и .

В распределительной бумажной хроматографии можно выделить нормальную и обращённо-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального подхода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная.

Этот метод применяется для разделения липофильных веществ.

Носитель[ | ]

При распределительной БХ носителем неподвижной фазы является целлюлоза в виде листов бумаги, которая даже в высушенном виде содержит значительное количество связанной воды.

Распределение происходит между связанной водой и растворителем, хотя присутствуют и адсорбционные эффекты. Для БХ применяется качественная бумага, которая может быть модифицирована в соответствии с поставленными задачами.

Также используется бумага из стекловолокна, которая устойчива к коррозионно-активным реагентам и обладает низкой адсорбционной способностью.

Позднее было обнаружено, что эта бумага пригодна и для разделения рацемических смесей, так как ацетилцеллюлоза сама является и потому энантиомеры перемещаются по ней с различной скоростью.

Как носители неподвижной липофильной фазы применяются также силиконы.

Методика[ | ]

В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают.

Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца.

До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат.

Затем образовавшиеся пятна, которые могут быть как видимые, так и невидимые, обнаруживают и отмечают.

Отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем стандартно обозначается Rf. Эта величина зависит от вещества, бумаги и природы растворителя. Бумажные хроматограммы могут проявляться в восходящем, нисходящем и горизонтальном токе растворителя, что слабо отражается на их качестве.

Поэтому выбор определяется другими факторами: по сравнению с восходящей хроматографией нисходящая имеет определённые преимущества. А именно, она требует меньше времени и не ограничена по длине пробега.

С другой стороны, для нисходящей БХ играет важную роль тщательность подготовки камеры, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, образованию полос.

Буш и Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер, горизонтальное хроматографирование, насыщение атмосферы камеры парами растворяющей системы, а главное — предварительную пропитку бумаги водной неподвижной фазой.Нередко весьма эффективна оказывается т.

 н. двумерная БХ, которая заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и повторно хроматографируют с другим растворителем под прямым углом к первоначальному направлению. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.

Обнаружение[ | ]

Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различные реагенты, или же по радиоактивности.

Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после , которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем.

Источники[ | ]

• Consden R., Gordon A. H., Martin A. J. P. Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper // Biochem. J. 1944. Vol. 38. P. 224—232. PubMedCentral
• «Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам» под ред. О. Микеша МИР 1982
• «Физическая биохимия» Фрайфелдер Д. МИР 1980

План:

Введение
• 1 Классификация
• 2 Носитель
• 3 Методика
• 4 Обнаружение
• 5 Пептидные карты

Источники

Бумажная хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сенджем, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Мартин и Сендж впоследствии были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии.

В последующие 10 лет этот метод получил огромное распространение, но с 1952 года бумажную хроматографию начал вытеснять новый метод тонкослойной хроматографии (являющийся по сути обобщением бумажной). Последний оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения.

Поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

1. Классификация

Бумажной хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на препаративную и аналитическую.

В распределительной бумажной хроматографии можно выделить нормальную и обращённо-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального подхода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная.

Этот метод применяется для разделения липофильных веществ.

2. Носитель

При распределительной БХ носителем неподвижной фазы является целлюлоза в виде листов бумаги, которая даже в высушенном виде содержит значительное количество связанной воды.

Распределение происходит между связанной водой и растворителем, хотя присутствуют и адсорбционные эффекты. Для БХ применяется качественная бумага, которая может быть модифицирована в соответствии с поставленными задачами.

Также используется бумага из стекловолокна, которая устойчивы к коррозионно-активным реагентам и обладает низкой адсорбционной способностью.

Позднее было обнаружено, что эта бумага пригодна и для разделения рецемических смесей, так как ацетилцеллюлоза сама является хиральным веществом и потому энантиомеры перемещаются по ней с различной скоростью.

Как носители неподвижной липофильной фазы применяются также силиконы.

3. Методика

В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают.

Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных сил растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца.

До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат.

Затем образовавшиеся пятна, которые могут быть как видимые, так и невидимые, обнаруживают и отмечают.

Отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем стандартно обозначается Rf. Эта величина зависит от вещества, бумаги и природы растворителя. Бумажные хроматограммы могут проявляться в восходящем, нисходящем и горизонтальном токе растворителя, что слабо отражается на их качестве.

Поэтому выбор определяется другими факторами: по сравнению с восходящей хроматографией нисходящая имеет определённые преимущества. А именно, она требует меньше времени и не ограничена по длине пробега.

С другой стороны, для нисходящей БХ играет важную роль тщательность подготовки камеры, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, образованию полос.

Буш и Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер, горизонтальное хроматографирование, насыщение атмосферы камеры парами растворяющей системы, а главное — предварительную пропитку бумаги водной неподвижной фазой. Нередко весьма эффективна оказывается т.

 н. двумерная БХ, которая заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и повторно хроматографируют с другим растворителем под прямым углом к первоначальному направлению. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.

4. Обнаружение

Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различные реагенты, или же по радиоактивности.

Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем.

5. Пептидные карты

Важной проблемой в молекулярной биологии является идентификация выделенного белка или установление изменения аминокислотного состава в мутантном белке. Для решения этих задач была разработана[кем?] техника «отпечатков пальцев».

Если белок подвергнуть расщеплению в стандартных условиях с использованием различных протеиназ (ферментов, специфически разрывающих определённые пептидные связи), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Число и типы получающихся пептидов зависят от строения данного белка и вида использованной протеиназы.

Этот метод находит несколько важных приложений в молекулярной биологии, среди которых можно отметить следующие: доказательство того, что один белок является продуктом расщепления другого; идентификация аминокислот, вводимых с помощью различных супрессорных тРНК; идентификация замен оснований в результате частичного мутагенеза.

Источники

• Consden R., Gordon A. H., Martin A. J. P. Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper // Biochem. J. 1944. Vol. 38. P. 224—232. PubMedCentral
• «Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам» под ред. О. Микеша МИР 1982
• «Физическая биохимия» Фрайфелдер Д. МИР 1980

скачать
Данный реферат составлен на основе статьи из русской Википедии. Синхронизация выполнена 20.07.11 11:38:18
Похожие рефераты: Хроматография, Бумажная свадьба, Бумажная маска, Бумажная просека, Бруссонетия бумажная, Бумажная луна, Бумажная ткань, Шапка бумажная, Берёза бумажная.

Категории: Хроматография.

Текст доступен по лицензии Creative Commons Attribution-ShareA.

Горная энциклопедия — значение слова Бумажная хроматография

хроматография на бумаге (a. paper chromatography; н. Papierchromatographie; ф. Chromatographie sur papier; и. cromatografia sobre papel), — метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на их распределении между подвижной и неподвижной жидкими фазами; в качестве носителя неподвижной жидкой фазы используют бумагу. Метод предложен англ. учёными А.

Мартином и Р. Синго в 1941. В Б. х. используют спец. сорта бумаги, различающиеся по номерам, с возрастанием к-рых плотность бумаги увеличивается. Бумага удерживает в порах воду, к-рая и является неподвижной жидкой фазой. Раствор пробы наносят в виде капель на лист бумаги на нек-ром расстоянии от края. После испарения растворителя край листа помещают в герметич.

камеру, содержащую проявитель — подвижную жидкую фазу (напр., спирты, кетоны, фенолы, четырёххлористый углерод, хлороформ и др., их смеси, а также смеси с неорганич. растворителями). При этом происходит передвижение исходного пятна по току проявителя и разделение смеси на компоненты. Если вещества не окрашены, то хроматограмму проявляют, напр.

, опрыскиванием раствором индикатора, рассматривают в ультрафиолетовых лучах и пр. Отношение расстояния Rf, пройденного пятном I, к расстоянию, пройденному фронтом проявителя m, при одинаковых условиях эксперимента является постоянной величиной; Rf для разл. веществ отличаются по значению и могут быть использованы для идентификации соединений.

Количественные определения разл. веществ в пятнах хроматограммы ведутся обычными аналитич. методами. Различают одномерные, двумерные, круговые, колоночные и электрофоретические хроматограммы (рис.).Виды хроматографии; а — до разделения; б, в — после первого и второго разделений смесей веществ. Описанным выше способом регистрируют одномерные хроматограммы.

Двумерную хроматограмму получают разделением пятен одномерной хроматограммы др. проявителем в направлении, перпендикулярном первому ряду пятен. На круговой хроматограмме пятно, помещённое в центре листа, размывают по концентрич. окружностям. В колоночной Б. х. разделение проводят на бумажных дисках, плотно вставленных в цилиндрич. колонку. Для получения электрофоретич.

хроматограмм бумажный лист пропитывают электролитом, закрепляют между электродами, наносят анализируемую смесь, подключают электроды к источнику постоянного тока и одновременно на бумагу подают подвижный растворитель в направлении, перпендикулярном направлению силовых линий электрич. тока.

В этом методе разделение компонентов происходит вследствие их неодинакового распределения между двумя жидкими фазами и разной скорости перемещения веществ под действием электрич. поля. Б. х. используют для разделения и анализа неорганич. и органич. веществ в природных и пром. материалах (напр., определяют смолы в нефтепродуктах, редкоземельные элементы в г. п.

и минералах).Литература: Блок Р., Лестранж Р., Цвейг Г., Хроматография на бумаге, пер. с англ., М., 1954; Руководство по аналитической химии, пер. с нем., М., 1975.

Н. В. Трофимов.

Смотреть значение Бумажная хроматография в других словарях

Бумажная Прибыль (убыток) — Нереализованная прибыль (убыток) по ценным бумагам, составляющим инвестиционный портфель, на основе сравнения текущей рыночной цены ценных бумаг с их……..

Экономический словарь

Валюта Бумажная — валюты государств, где изъятие из оборота от металлических денег — решающее условие для эмиссии банкнот.
Экономический словарь

Марка С Объявленной Стоимостью, Бумажная — — марка, накопление некоторого количества которых, дает покупателю право бесплатного приобретения товара из ассортимента того магазина, где получены марки.

Экономический словарь

Прибыль, Бумажная Книжная — — прибыль, которая образовалась в результате переоценки активов по более высокой цене или пассивов по более низкой.
Экономический словарь

Paper Profit («бумажная» Прибыль) — Прибыль, показанная в записях операций и в бухгалтерской отчетности организации, могущая оказаться нереализованной. Это может произойти вследствие падения актива……..
Экономический словарь

Хроматография — -и; ж. [от греч. chrōma (chrōmatos) — окрашивание, краска и graphō — пишу] Отрасль науки, которая занимается разделением и анализом смесей.
Толковый словарь Кузнецова

Гель-хроматография — гель–фильтрация – способ разделения веществ по размеру их молекул с использованием так называемых молекулярных сит (сефадексов).
Словарь микробиологии

Хроматография — метод разделения и анализа смесей, основанный на различном распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюентом). X. может основываться……..
Словарь микробиологии

Гель-хроматография — (син. гель-фильтрация) метод разделения веществ с разной молекулярной массой, основанный на различии скорости их диффузии в гелях; используется в молекулярной биологии,……..
Большой медицинский словарь

Бумажная Хроматография — , вид ХРОМАТОГРАФИИ, в котором применяется абсорбирующая бумага. Анализируемая смесь растворяется, затем капля раствора помещается на лист бумаги возле его края. Лист……..
Научно-технический энциклопедический словарь

Газовая Хроматография — , вид ХРОМАТОГРАФИИ, при котором переносящей средой является газ. Используется для анализа или разделения газовой смеси, часто образованной из нагретой жидкости. «Несущий»……..
Научно-технический энциклопедический словарь

Тонкослойная Хроматография — , метод ХРОМАТОГРАФИИ, в которой компоненты смеси жидкостей разделяются за счет различного поглощения в тонком слое материала, выложенного на стеклянную пластинку………
Научно-технический энциклопедический словарь

Хроматография — , обобщающее название ряда методов химического АНАЛИЗА, при котором происходит разделение, идентификация и измерение веществ. была изобретена (в 1906 г.) русским ботаником……..
Научно-технический энциклопедический словарь

Бумажная Архитектура — не предназначенные для конкретногостроительства, свободные архитектурные эскизы и чертежи…2) Направление врусской архитектуре и изо-искусстве последней четверти……..
Большой энциклопедический словарь

Хроматография — (хромато- + греч. grapho писать, изображать) метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на различном распределении их компонентов между подвижной (газ или жидкость)……..
Большой медицинский словарь

Хроматография — (от греч. chroma — род. п. chromatos — цвет и …графия),метод разделения и анализа смесей, основан на различном распределении ихкомпонентов между двумя фазами — неподвижной и подвижной……..
Большой энциклопедический словарь

Целлюлозно-бумажная Промышленность — отрасль промышленности, выпускающаяразличные виды волокнистых полуфабрикатов (в т. ч. сульфитную и сульфатнуюцеллюлозу), бумагу, картон и изделия из них. Основное сырье……..
Большой энциклопедический словарь

Гель-хроматографи́я — (син. гель-фильтрация)метод разделения веществ с разной молекулярной массой, основанный на различии скорости их диффузии в гелях; используется в молекулярной биологии,……..

Медицинская энциклопедия

Хроматография — (chromatography) — метод разделения компонентов смеси при помощи избирательной адсорбции. Два таких метода широко применяются в медицине, например, для разделения смесей аминокислот………
Психологическая энциклопедия

Хроматография (chromatography) — метод разделения компонентов смеси при помощи избирательной адсорбции. Два таких метода широко применяются в медицине, например, для разделения смесей аминокислот………
Медицинский словарь

Хроматография — Iфизико-химический метод разделения компонентов жидких или газообразных смесей, основанный на распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых……..

Медицинская энциклопедия

Бумажная Тара — Упаковочные изделия из бумаги: мешки, пакеты, конверты, коробки, стаканы, этикетки для завертки кондитерских и молочных продуктов и др.
Полиграфический словарь

Посмотреть в Wikipedia статью для Бумажная хроматография

ОФС.1.2.1.2.0002.15 Хроматография на бумаге

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Хроматография                                       ОФС.1.2.1.2.0002.15

на бумаге                                                  Взамен ст. ГФ XI, вып.1

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой). Совокупность зон адсорбции, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.

Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется  фактором удерживания Rf, (см. ОФС «Хроматография»).

Область применения

Бумажная хроматография может использоваться для установления подлинности, чистоты и количественного определения анализируемого вещества.

Подлинность подтверждается при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного вещества. Если образцы идентичны, то соответствующие им зоны адсорбции на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения Rf.

Для идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно, характеризующее зону адсорбции. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения Rf были отличны от 0 и не превышали 1.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения Rf. О степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности окраски (или поглощения) обнаруживаемых на хроматограмме зон адсорбции примесей. примесей может быть определено полуколичественно.

Для этого на одном листе бумаги одновременно хроматографируют определенное количество анализируемого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c различными, точно известными концентрациями.

примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее зону адсорбции на хроматограмме по совокупности площади зоны адсорбции и интенсивности окраски (или поглощения) с зонами адсорбции свидетеля.

Для количественного анализа применяют специальные приборы, позволяющие проводить измерения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для обработки хроматограмм в видимой области спектра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.

можно также проводить количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого зоны адсорбции вырезают и экстрагируют определяемое вещество подходящим растворителем. анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых концентраций и учитывающим строение анализируемого вещества.

Проба испытуемой смеси может наноситься либо точечно на линию старта, либо в виде равномерной полосы вдоль всей линии старта, при этом первичная зона адсорбции будет иметь вид пятна, а во втором случае – полосы, параллельной линии старта.

Оборудование

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие наблюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры.

Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришлифованной крышкой и дополнительно герметизированные.

На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.

Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги.

Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу помещают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо наливают на дно камеры.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, входящих в состав подвижной фазы.

Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в фармакопейных статьях.

Методики хроматографического разделения

Бумажная хроматография может быть одномерной и двумерной.

Одномерная бумажная хроматография предполагает точечное нанесение или нанесение в виде полосы пробы исследуемой смеси на линию старта и последующее хроматографирование в одном направлении (рис. 1).

Примерная схема одномерной бумажной хроматографии

Рисунок 1 – Примерная схема одномерной бумажной хроматографии

Двумерная хроматография предполагает последовательное прохождение подвижной фазы в двух перпендикулярных направлениях, что позволяет обеспечить более четкое разделение смеси анализируемых веществ (рис. 2).

Примерная схема двумерной бумажной хроматографии

Рисунок 2 – Примерная схема двумерной бумажной хроматографии

Нисходящая хроматография

На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.

Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см.

Если минимальное, необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге первичную зону адсорбции в виде пятна, превышающего в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерную диффузию на линии старта.

После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшейся при этом первичной хроматограммы полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч.

В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу.

Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в фармакопейной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и сушат на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение фронта подвижной фазы. Детекцию зон адсорбции осуществляют согласно указаниям фармакопейной статьи.

Восходящая хроматография

Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне.

Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2 – 3 см.

В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.

Подготовка фаз и бумаги

При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фазы, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке. При этом в фармакопейной статье должно быть указано, какую из фаз используют для хроматографирования.

Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации «для хроматографии» разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приблизительно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А – ширина полосы (см), К – количество хроматограмм на полосе.

На каждой полосе бумаги для обозначения мест нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую  линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.

На приготовленные таким образом листы фильтровальной бумаги, если указано в фармакопейной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т.п.

) смешивают с легколетучими растворителями и в полученную смесь на 1 – 2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги.

Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, сушат, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.

Детекция зон адсорбции

По окончании хроматографирования хроматограммы подсушивают до удаления следов растворителей и просматривают в видимом или ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны детектора, указанной в  фармакопейной статье), отмечая при этом зоны адсорбции. В ряде случаев для обнаружения зон адсорбции хроматограмму подвергают обработке специальными реагентами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные продукты реакции, путем опрыскивания или погружения в раствор реагента.

Способ детекции зон адсорбции должен быть обязательно указан в соответствующей фармакопейной статье на лекарственное средство.

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.2.0002.15 Хроматография на бумаге

Бумажная хроматография — курсовая работа

     Одним из наиболее важных свойств сверхкритического состояния — это способность к растворению веществ. Изменяя температуру или давления флюида можно менять его свойства в широком диапазоне. Так, можно получить флюид, по свойствам близкий либо к жидкости, либо к газу.

Так, растворяющая способность флюида увеличивается с увеличением плотности (при постоянной температуре). Поскольку плотность возрастает при увеличении давления, то меняя давление можно влиять на растворяющую способность флюида (при постоянной температуре).

В случае с температурой зависимость свойств флюида несколько более сложная — при постоянной плотности растворяющая способность флюида также возрастает, однако вблизи критической точки незначительное увеличение температуры может привести к резкому падению плотности, и, соответственно, растворяющей способности [5].

Сверхкритические флюиды неограниченно смешиваются друг с другом, поэтому, при достижении критической точки смеси система всегда будет однофазной. Приблизительная критическая температура бинарной смеси может быть рассчитана как среднее арифметическое от критических параметров веществTc(mix) = (мольная доля A) x TcA + (мольная доля B) xTcB.

Если необходима большая точность, то критические параметры могут быть рассчитаны с использованием уравнений состояния, например с помощью уравнения Пенга-Робинсона. 

     Уникальная способность сверхкритического флюида растворять большие объемы газа, в особенности H2 и N2, в купе с высоким коэффициентом диффузии, делает его использование в качестве растворителя химических реакций его чрезвычайно перспективным. Изменение температуры и давления позволяют влиять на свойства растворителя и маршрут реакции, что делает возможным более высокие выходы целевого продукта. Также следует заметить, что использование CO2 абсолютно экологично.

1.2.Классификация по принципу фракционирования

     Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры.

Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке.

Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворителем, так и с адсорбентом.

     В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул.

К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда.

Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

     Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста.

Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко — другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии.

Основная причина этого — недостаточная механическая прочность большинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

     Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. Поэтомуобычнопорядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы.

Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селективности — тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи.

Например, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

     Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Б.Аффинная хроматография

     Относительно слабое обратимое взаимодействие между молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т. д.

Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е.

методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (рис.5).

     В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования   смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции.

При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же   аффинному   сорбенту.

     Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции.

В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией.

Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

     Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз.

Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации.

     Одной изразновидностьюафинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (рис. 6). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированныеплазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененнымполигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 6. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы. 

Рис. 7. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, прикреплены к гранулам, и развернутый или неправильно свернутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильнойконформации. 

В.Гель-фильтрация

     В этом простейшем варианте хроматографиимолекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними.

Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы.

В подавляющем большинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а материалы   гранул   гидрофильны. 

     Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор.

Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е.

часть объема неподвижной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества,  растворенного   в  подвижной фазе.

Если в составе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникающие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвижной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе.

Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулыдостигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные.

Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений еффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы доступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль  колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 8. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в образце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, которые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный размер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения. 

     Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели.

Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем.

Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исключение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.