МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

Кому нужна молекулярная диагностика

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

:  4 / 5

Можно ли есть яйцо при аллергии на яичный белок и почему не помогает АСИТ? О молекулярной диагностике – методе современного анализа на аллергены рассказывает Ольга Гурьевна Елисютина, врач аллерголог-иммунолог, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения аллергии и иммунопатологии кожи Института иммунологии ФМБА России.

Три года Александр Николаевич честно проходил курс аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ), но так и не избавился от симптомов поллиноза. В медцентре, где его лечили, не смогли объяснить – почему. Вроде кожные пробы и анализ крови на специфические иммуноглобулины Е (IgE) дали положительный результат… Отправили разбираться в Институт иммунологии.

Там ему предложили провести более точный анализ.

Почему не помогает АСИТ

«Пациенты нас часто спрашивают: аллергия на пыльцу березы диагностирована, а АСИТ не помогает, – рассказывает Ольга Гурьевна. – Почему? Дело в том, что, например, у пыльцы березы не один, а минимум шесть аллергенных компонентов.

Они представляют собой охарактеризованные молекулы (то есть строение и функции этих молекул хорошо изучены, а также известно, к какому семейству белков они относятся и какие реакции могут вызывать), которые, как правило, являются белками или гликопротеинами, и именно они определяются специфическими IgE-антителами.

Истинную сенсибилизацию вызывают только определенные аллергенные компоненты.

Если эти молекулы связываются со специфическими IgE-антителами более чем у 50% пациентов с аллергией к одному и тому же источнику, их называют мажорными, если менее чем у 10% пациентов – минорными.

Главный, или мажорный, аллерген пыльцы березы – Bet v 1 (названия аллергенов образованы от латинских наименований; Bet – это Betula verrucosa, береза повислая, или бородавчатая). А есть еще минорные аллергены, например Bet v 2, Bet v 4 и другие».

Кожные пробы, как и анализы крови на специфические IgE, как правило, проводят с экстрактами аллергенов, и они показывает реакцию на все аллергены березовой пыльцы. Положительный результат таких исследований может означать иммунный ответ как на мажорный Bet v 1, так и на минорные Bet v 2 и Bet v 4.

Точно определить, какой именно компонент вызывает аллергию, помогает молекулярная аллергодиагностика: она определяет уровень специфических иммуноглобулинов Е не к экстрактам аллергенов, а к отдельным их компонентам.

Именно такой анализ провели Александру Николаевичу. Тут-то и выяснилось, почему АСИТ не помогал! Оказывается, у него специфические IgE-антитела вырабатывались не к основному, мажорному аллергену пыльцы березы Bet v 1, а к Bet v 4.

Этот компонент является маркером перекрестных реакций между пыльцой деревьев, злаковых и сорных трав. И действительно, после дополнительных исследований у Александра Николаевича обнаружилась истинная сенсибилизация к аллергенам тимофеевки Phl p 1, 2, 4, 5, 7.

Лечили его аллергенами пыльцы березы, а надо было аллергенами трав, потому что Bet v 4 обладает перекрестными свойствами с их пыльцой, точнее, с аллергеном Phl p 7.

Как это работает

«При традиционном методе диагностики берут источники аллергенов, например, пыль, плесневые грибы, делают из них экстракты и с ними ставят кожные пробы, – объясняет Ольга Гурьевна.

– Но такой экстракт содержит много разных молекул, и когда мы проводим диагностику с использованием экстрактов, будь то кожные пробы или определение специфических IgЕ, мы не можем установить, какой именно компонент вызывает у пациента аллергическую реакцию».

А молекулярная диагностика может! Проводят ее с помощью определения специфических IgE-антител к отдельным компонентам (в лабораториях доступны лишь немногие из них) или ISAC-теста (ISAC – иммунный твердофазный аллергочип), разработанного учеными Венского медуниверситета. Кровь на анализ можно брать как из вены, так и из пальца, что очень удобно для детей.

«ISAC-тест позволяет определить сразу 112 компонентов из 51 источника аллергенов, – комментирует доктор Елисютина. – Когда мы стали с ним работать, то поняли, что у нас случались ошибочные назначения.

Бывало, человек рассказывал, что летом задыхается, мы назначали АСИТ тимофеевкой, но безрезультатно.

А молекулярный анализ показал, что пациент сенсибилизирован к тимофеевке за счет минорного Phl p 7 и такая терапия ему вряд ли поможет».

Что еще дает тест

Молекулярная диагностика неоценима при пищевой аллергии. Например, в белке яйца описано минимум пять белковых компонентов: овомукоид (Gal d 1), овальбумин (Gal d 2), кональбумин (Gal d 3), лизоцим (Gal d 4), ливетин (Gal d 5). Какие-то из этих белков термостабильны, то есть не разрушаются при нагревании, какие-то – термолабильны: нагревание снижает их аллергенное действие до нуля.

«Овомукоид – самый страшный компонент белка куриного яйца, он термостабилен, – говорит Ольга Гурьевна. – И если у ребенка сенсибилизация именно к нему, то яйца ему нельзя ни в каком виде.

А если малыш сенсибилизирован к овальбуминам, то варившееся 10–20 минут яйцо он может есть.

Без молекулярной диагностики мы бы такие рекомендации дать не смогли, а между тем это очень важно, потому что дети должны расти, получать белок из разных источников».

То же касается молока. Сывороточные альбумины в нем разрушаются кипячением, а вот казеин Bos d 8, который вызывает самые тяжелые реакции, термостабилен. Ребенку с аллергией к казеину вообще никакое молоко нельзя: ни коровье, ни козье, ни даже грудное. Только гидролизат (специальное детское питание, где белки расщеплены до аминокислот – отдельных белковых компонентов).

О вреде самолечения

«Не советую заниматься самолечением и самодиагностикой, тратить на это деньги, – предупреждает Ольга Гурьевна. – Пациент должен прийти к врачу-аллергологу, а тот уже разберется, аллергия ли это. Может, это вирусная инфекция или кожный зуд из-за сахарного диабета – мало ли какие могут быть причины всех тех состояний, которые наши пациенты называют аллергией!»

«Часто бывает: краснеет лицо, и сразу мысль – аллергия! – продолжает врач. – А я понимаю, что это чисто кожная проблема: розацеа (хроническое заболевание кожи лица с покраснением и сыпью.– Ред.) или угревая болезнь. Тогда вообще любая аллергодиагностика – пустая трата денег».

«Мы собираем анамнез, проводим кожные пробы, анализ на специфические IgE, и только когда неэффективен АСИТ или мы не можем понять, почему клинические данные не соответствуют лабораторным, назначаем ISAC-тест. К тому же правильно интерпретировать и прокомментировать полученные результаты может только клиницист, который работает с пациентами», – резюмирует доктор Елисютина.

Елена Туева

Войдите или зарегистрируйтесь, чтобы оставить коментарий

Молекулярно генетический метод исследования в онкологии

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

Наряду с гистологическим и иммуногистохимическим  исследованиями новообразований, молекулярно-генетические исследования рака все более плотно входят в арсенал врачей-онкологов.

Среди проводимых исследований опухолевых тканей молекулярно-генетические с каждым годом прибавляют свою долю.

И необходимость подобного рода анализов будет только расти.

Главным образом, выявление мутации генов необходимо для назначения дальнейшей таргетной терапии рака.

Это связано с тем, что использование подавляющего большинства таргетных препаратов, предполагает определение некой мишени, на которую будет воздействовать лекарственное средство.

Молекулярно генетические методы исследования позволяют выявить мутации в генах и определить на основании этого чувствительность опухоли к тем или иным таргетным препаратам.

В статье мы рассмотрим цели исследования для разных видов злокачественных новообразований.

Как проводится анализ на мутацию генов

Если же говорить о том, как происходит это исследование с точки зрения больного, и что ему для этого нужно сделать, то это выглядит достаточно просто.

На анализ предоставляется фрагмент опухоли, полученный в процессе биопсии либо во время операции.

Подходят фрагменты опухолей, удаленных даже несколько лет назад, при  условии что они должным образом были сохранены (в парафиновых блоках).

В лабораторию нужно предоставить как раз такой парафиновый блок.

Парафиновый блок  представляет из себя небольшой парафиновый слиток, размером с монету.

Врач возьмет фрагмент опухолевой ткани, выделит из него цепочку генов и определит какого рода мутации какого гена присутствуют в данном конкретном новообразовании конкретного пациента.

Далее, на основании полученных данных онколог сможет назначить пациенту подходящий таргетный препарат.

Определение мутации генов при онкологических заболеваниях делаются в лабораториях при крупных клиниках и научно-исследовательских институтах.

К сожалению, этот анализ не всегда назначается онкологами. Причины тому разные, бывает, особенно на периферии, что не все онкологи   достаточно разбираются в этой теме, либо их лечебное учреждение не имеет возможности отправить фрагмент опухоли больного на это исследование.

Ряд врачей, почему-то, не считает нужным назначать этот анализ, возможно, и потому, что не все лечебные учреждения в состоянии обеспечить пациента препаратами таргетной терапии, которые назначаются по его результатам.

В этом случае инициативу приходиться брать в свои руки больному или его родственникам, а также брать на себя соответствующие финансовые затраты.

Стоимость большинства из вышеперечисленных исследований находится в диапазоне от 5000 до 15000 рублей (по состоянию на 2017 год).

Как выглядит заключение по итогам анализа

Перед врачом-генетиком ставится цель исследования. Поэтому рассмотрим цели исследования для наиболее частых видов опухолей.

Лимфомы

Есть ряд подтипов В-крупноклеточных лимфом из активированных В-клеток и из В-клеток герминативного центра.

При молекулярно-генетическом исследовании лимфомы определяются мутации с-МYC, ВСL2,  ВСL6, ССND1

От общего уровня активности и от механизмов, которые приводят к гиперэкспрессии указанных генов, зависит прогноз и подход к лечению заболевания.

Рак молочных желез и яичников

При раке молочной железы и яичников определяются мутации BRCA1, BRCA2. Полученные результаты имеют прогностическое значение, а также позволяет определить риск заболеть раком молочной железы, если у родственниц есть рак яичников и молочной железы.

Также определяется мутация в случае, если у пациентки есть рак молочной железы или яичников. Эти данные используются для подбора наиболее эффективного лечения.

При этом различные лаборатории могут определить как наиболее часто встречаемые мутации BRCA1, BRCA2, так и выявить все возможные BRCA1,  BRCA2.

Разница в цене между первым и вторым вариантом может составлять 7-8 раз. Как правило, второй вариант нужен очень и очень редко, в большинстве случаев достаточно первого.

При раке молочной железы методом FISH определяется амплификация HER-2 neu. Это позволяет определить чувствительность опухоли к таргетному препарату «Герцептин».

Также этим методом определяется амплификация TOPO2A. Это необходимо для назначения таких препаратов, как, например, Пертузумаб, Лапатиниб, а также при назначении Герцептина.

Опухоли желудка

Те же самые исследование, а именно HER-2 neu  TOPO2A назначаются для определения чувствительности к Герцептину опухолей желудка.

Также при гастроинтестинальной стромальной опухоли желудка проводится исследование гена c-KIT, а именно 9,11,13,17 экзонов этого гена, а также 12,18 экзонов гена PDGFRa.

Немелкоклеточный рак легкого

При немелкоклеточном раке легкого определяются мутации EGFR. В частности определяются проблемы в 18-м, 19-м и 21 экзонах, а также T790M в 20-м экзоне.

Это необходимо для того, чтобы врач смог определить будут ли таргетные препараты, воздействующие на эпидермальный фактор роста опухоли эффективны для больного.

Также при этой форме рака определяется наличие и уровень  PD-L1. При положительном определении такого белка к пациенту может применять новейший препарат  Атезолизумаб (Тецентрик).

Этот препарат на данный момент считается прорывом в лечении немелкоклеточного рака легкого.

Уротелиальный рак

При уротелиальном раке долгое время не удавалось добиться очень серьезных, прорывных результатов именно в лекарственной терапии.

С появлением Тецентрика у таких пациентов появилась надежда на успешное лечение. Подробнее о Атезолизумабе читайте по ссылке.

Для определения возможности и эффективности  применения этого препарата необходимо исследование в  клетках опухоли белка  PD-L1.

Также определение PD-L1 и PD-L2  необходимо для назначения препарата  Ниволумаб (Опдиво).

Щитовидная железа

При планировании лечения медуллярного рака щитовидной железы имеет смысл выявление перестроек RET методом FISH, так как перестройки гена RET имеют большое прогностическое значение при этой болезни.

Колоректальный рак

Для лечения этого новообразования фармацевтическими компаниями предложено, пожалуй, самое большое количество таргетных препаратов.

Важно правильно подобрать необходимые. Для этого определяют второй, третий, четвертый экзоны KRAS, второй и третий экзоны NRAS  и мутацию 15-ого экзона BRAF. На основании этого врач подбирает наиболее эффективный таргетный препарат.

Также при колоректальном раке может определяться индекс микросателитной нестабильности (MSI). Этот индекс необязателен при назначении лечения, однако он идет как прогностический фактор. При наличии такой нестабильности лечение будет эффективнее примерно на 15%.

Также определяют мутацию PI3KCA. При ее определении врач понимает, что эффективность препаратов, нацеленных на эпидермальный фактор опухоли, будет ниже ожидаемой, поэтому предложит иной вариант лечения.

Меланома

Для подбора препаратов таргетной терапии определяется мутация 15 экзона гена BRAF, несколько реже — 11, 13 и 17 экзонов c-KIT, а также 2 и 3 экзонов гена NRAS.

Надо сказать, что при первичной меланоме, как правило, определяются BRAF мутации, c-KIT дополнительно определяются при метастазирующей меланоме.

Если обнаружатся мутации в  c-KIT, то будут применены дополнительные препараты.

Сейчас при лечении меланомы появляются очень хорошие таргетные препараты, которые позволяют перейти на совершенно другой уровень лечения меланомы, даже метастазированной. Но для этого нужно знать наличие клеточных мутаций.

Саркомы

Молекулярно-генетический анализ используется и при саркомах.

При синовиальной саркоме определяется перестройка SYT. Это исследование необходимо для окончательного подтверждения диагноза.

При саркоме Юинга определяется перестройка EWS.

Где проводится молекулярно генетическая диагностика

В интернете вы найдете большое количество лабораторий, которые предлагают свои услуги по определению мутации генов. Вплоть до того, что курьер от лаборатории может взять парафиновый блок у вас, либо вы его можете отправить в лаборатории. Как именно можно отправить, вам разъяснят в лаборатории.

Большинство исследований, которые проводят такие независимые лаборатории, проводятся на базе крупных клиник и НИИ Москвы и Санкт-Петербурга.

Хорошо зарекомендовала себя лаборатория 62 больницы города Москвы.

Молекулярная генетика в клинической онкологии сейчас активно развивается, однако, некоторые виды исследований, например, определение уровня PDL у нас в стране можно выполнить только в трех центрах, либо за границей.

Молекулярно генетические анализы и таргетная терапия — современные методы диагностики и лечения рака

Молекулярный анализ в диагностике узлов щитовидной железы неопределенной цитологии (Bethesda III)

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

  • Распространенность узловых образований щитовидной железы чрезвычайно высока. В большинстве случаев узловые образования щитовидной железы — доброкачественные.
  • Молекулярная диагностика может помочь в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных образований.

  • Целью настоящего исследования было определение целесообразности анализа мутаций генов BRAF, NRAS, KRAS и HRAS с использованием доступных молекулярных методов для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы.

  • Ретроспективное исследование, в котором была проанализирована группа пациентов, перенесших диагностическую операцию на щитовидной железе, на наличие или отсутствие специфических мутаций, ассоциированных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы в образцах тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ).

  • Маркеры: мутации в генах BRAF, KRAS, NRAS и HRAS.
  • Результаты молекулярного анализа сопоставлялись с гистологическим материалом, полученным в результате тироидэктомий, для определения чувствительности и специфичности этих молекулярных методов для классификации неопределенных узлов щитовидной железы.

  • В исследование были включены шестьдесят пациентов с неопределенными результатами биопсий. По результатам гистологического исследования у 23 пациентов выявлены злокачественные опухоли, а у 37 — доброкачественными.
  • В 18 случаев выявлена мутация (среди 10 злокачественных и 8 доброкачественных образований).

    Чувствительность BRAF, KRAS HRAS, и NRAS 8,7; 8,7; 8,7; 17,4 , а специфичность составила 100; 83,7; 100 и 94,6 соответственно.

  • Молекулярный анализ — перспективный метод в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных образований, однако он требует дальнейшего изучения и совершенствования.

  • По данным статистики, у 20-70% людей обнаруживают узлы в щитовидной железе.  Большинство из этих образований — доброкачественные.

  • Стандартная схема обследования пациента с узловыми образованиями щитовидной железы:
    • исследование уровня ТТГ
    • проведение ультразвукового исследования
    • поведение ТАБ (около 20% заключений ТАБ характеризуют узлы щитовидной железы как неопределенного значения, доля злокачественных образований в этой группе составляет около 20%)
  • Предоперационный молекулярный анализ биоптата — это метод исследования щитовидной железы, который может значительно помочь в диагностике образований с неопределенным злокачественным потенциалом.
  • Для диагностики злокачественных образований щитовидной железы выделены несколько мутаций:
    • протоонкоген B – RAF
    • протоонкоген NRAS
    • протоонкоген KRAS, который представляет собой ГТФ-азу и является компонентом многих сигнальных систем
    • рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом гамма (PPARg)
    • ген рецептора тиреотропного гормона (TSHR).
  • Были созданы новые молекулярные тесты — классификатор экспрессии генов Afirma и ThyroSeq v2, анализирующие  образец, полученный в результате ТАБ на наличие мутаций.
  • Внедрение высокоточной молекулярной оценки узловых образований щитовидной железы с неопределенной цитологией позволит повысить информативность оценки риска злокачественности новообразований щитовидной железы и избежать ненужных хирургических вмешательств.
  • В ретроспективном исследовании были рассмотрены истории пациентов за период с август 2007 года по июль 2012 из клиники Святого Джозефа в Гамильтоне, Канада.
  • наличие биопсии щитовидной железы с неопределенной цитологией (категория III по Bethesda)
  • достаточное количество клеток в материале
  • наличие окончательного хирургического диагноза
  • возраст старше 18 лет
  • отягощенный семейный анамнез по раку щитовидной железы
  • наличие в анамнезе облучения
  • пациенты без окончательного хирургического диагноза
  • Молекулярный анализ онкогенов проводился с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и пиросеквенирования (Qiagen): мутации гена BRAF в кодоне V600: V600E / К / D / R, мутации KRAS в кодонах 12/13 : G12A / D / R / C / S / V, G13D, мутации NRAS в кодоне 61: Q61R / K / L / H / P / E / Q и HRAS в кодоне 61 : Q61R / K / L / H / P.
  • В исследование включены шестьдесят пациентов, соответствующие критериям включения и исключения.
  • По данным гистологического исследования операционного материала у 37 пациентов (62%) выявлены доброкачественные образования, а у 23 (38%) — злокачественные.
  • Наиболее распространенным доброкачественным образованием была фолликулярная аденома, а среди злокачественных образований наиболее часто встречалась папиллярная карцином

Гистологический анализ образцов

Доброкачественные поражения Злокачественные поражения
Узловой  гиперплазия 7 (12%) Папиллярная карцинома классический вариант  9 (15%)
Аденоматозный коллоидный узелок 8 (13%) Микрокарцинома 5(8%)
Аденома из клеток Гюртля 1 (2%) Папиллярная карцинома, фолликулярный вариант 7(12%)
Фолликулярная аденома 17 (28%) Папиллярная карцинома, онкоцитарный вариант 1(2%)
Атипичная фолликулярная аденома 4 (7%) Слабо дифференцированная фолликулярная карцинома 1(2%)
Всего 37(62%) Всего 23(38%)
  • У двух пациентов выявлены мутации гена BRAF, у восьми — гена HRAS, у двух — KRAS и у шести NRAS
  • BRAF: специфичность 8,7%, чувствительность 100%, прогностическая ценность положительного результата 100% прогностическая ценность отрицательного результата 63,8%.
  • HRAS: специфичность 8,7%, чувствительность 83,7%, прогностическая ценность положительного результата 25%, прогностическая ценность отрицательного результата 59.6%.
  • KRAS: специфичность 8,7%, чувствительность 100%, прогностическая ценность положительного результата 100%, прогностическая ценность отрицательного результата 63,8%.
  • NRAS: специфичность 17,4%, чувствительность 94,6%, прогностическая ценность положительного результата 66,7% и прогностическая ценность отрицательного результата 64,8%.
  • В целом, в сочетании специфичность молекулярного анализа составила 43,5%, чувствительность 78,4%, прогностическая ценность положительного результата 55,5%, а отрицательного 69%.

Специфичность, чувствительность, отрицательная и положительная прогностическая значимость для каждого гена

Молекулярная мутация

Количество

положительнных случаев

Злокачественные поражения Доброкачественные поражения SP SN PPV NPV
BRAF 2 2 0 8.7 100 100 63.8
HRAS 8 2 6 8.7 83.7 25 59.6
KRAS 2 2 0 8.7 100 100 63.8
NRAS 6 4 2 17.4 94.6 66.7 64.8
Всего 18 10 8 43.5 78.4 55.5 69

Обсуждение

  • AFIRMA и ThyroSeq v2 являются эффективными тестами для диагностики доброкачественных образований, однако высокая стоимость затрудняет использование их в качестве рутинного метода в Канаде.

     В AFIRMA рассматривается экспрессия  мРНК 167 генов, в ThyroSeq v2 — 13 генов и 42 рекомбинантных гена, встречающихся при  раке щитовидной железы.

  • В данном исследовании молекулярная диагностика была упрощена: рассматривались только 4 гена, что было сделано исходя из экономических соображений.

  • Чувствительность классификатора AFIRMA 92%, специфичность 52% и прогностическую ценность отрицательного результата 90%. ThyroSeq v2 обладает чувствительностью 90%, специфичностью 93%, прогностической ценностью положительного результата 83% и прогностическая ценность отрицательного результата 96%.

  • При сочетании панелей для четырех генов вошедших в данное исследование специфичность составила 43,5%, чувствительность 78,4%, прогностическая ценность положительного результата 55,5%, прогностическая ценность отрицательного результата 69%, что хотя и не приближается по значениям чувствительности и специфичности к Afirma и ThyroSeg v2,  но может оказаться полезным в случае выявления мутации.
  • Молекулярный анализ помогает определить, у каких пациентов имеются доброкачественные узлы, а у каких — подозрительные на злокачественные. Молекулярный анализ предоставляет дополнительную информацию для пациентов, когда они принимают решение о тактике отностительно неопределенных узлов щитовидной железы.
  • Молекулярное исследование призвано в будущем уменьшить количество диагностических хирургических операций.

Ограничения исследования

  • Для определения чувствительности и специфичности анализа этого набора генов в клинических условиях необходимо проведение исследований на большем числе пациентов.
  • Небольшой размер выборки является ограничением исследования и истинной чувствительности и специфичности этой комбинаций маркеров.

  • Неясно, будет ли исследование этих четырех маркеров иметь значение для изменения рекомендаций по дальнейшей тактике ведения.

В течение ближайших лет молекулярные тесты станут доступны в клинической практике.

И, хотя существуют определенные ограничения, молекулярная диагностика может быть перспективной в предоставлении пациентам с дополнительной информации об их заболевании.

Заключение

  • Несмотря на небольшой размер выборки, молекулярный метод остается перспективным в определении потенциала злокачественности узловых образований щитовидной железы даже с этой ограниченной группой из четырех генов
Поделиться:
Нет комментариев

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.

×
Рекомендуем посмотреть