РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК

Рестрикция ДНК

РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК

Рестрикцией ДНК (латинское restrictio – ограничение) называется процесс ферментативного разделения цепочек дезоксирибонуклеиновой кислоты на отдельные фрагменты, представляющие собой последовательность нуклеотидов различного размера.

Этот процесс является частью одного из важнейших внутриклеточных защитных механизмов от проникновения и встраивания в геном чужеродного генетического материала. Он контролируется сложной системой клеточной регуляции. Другой стороной применения этого явления является синтетическая генная инженерия, которую нельзя было бы вообразить без возможности разделять ДНК-материал на фрагменты.

История изучения

Механизмы рестрикции внутри системы защиты клетки неразрывно связаны с механизмом модификации, и начиная с середины 20 века многие учёные задавались целью изучить эти явления. Впервые фермент-рестриктаза, способный неспецифически делить последовательность ДНК, был обнаружен в бактерии E.coli (кишечной палочке) учёными Юанем и Мезельсоном (1968г).

Было выяснено, что бактерии способны легко отличать «чужеродный» генетический материал (независимо от пути его проникновения в клетку) от собственного, в результате чего привнесённая ДНК последовательно расщеплялась на мелкие фрагменты.

Распознавание происходит с помощью специальных «меток» — модифицированных (метилированных) участков собственной ДНК, во «вражеском» же геноме такие участки отсутствуют.

В 1970г. исследователи Смит и Вилькокс выделили из гемофильной палочки первую рестриктазу, которая могла расщепить только специфические последовательности ДНК.

В последующем было открыто более 500 различных рестрикционных эндонуклеаз, которые распознают, прикрепляются, расщепляют разные последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Механизм действия

Специфичность

Все эндогенные рестриктазы высокоспецифичны. Они четко распознают определенную цепочку нуклеотидов, но могут «разрезать» её по-разному. Как правило, узнается короткая последовательность из 4 — 6 оснований.

Особенностью процесса рестрикции-модификации является защита собственной ДНК от сайт-специфичной эндодезоксирибонуклеазы (рестриктазы) с помощью метилирования.

Этот процесс осуществляется ферментами метилазами, также действующими избирательно к азотистым основаниям, расположенным в определенном порядке, и добавляющими к ним метильные группы, делая сайт молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты устойчивым к рестрикции.

Группы рестриктаз

Выделяют три особенных класса рестриктаз. Они отличаются по нескольким признакам: строению, точкам применения.

Рестриктазы первого класса разрезают молекулы генетического материала в произвольных точках, а ферменты второго и третьего классов — в строго определенных. При этом эндорестриктазы второго класса действуют в пределах одного сайта, а третьего — рядом с сайтом узнавания.

Рестриктазы второго класса имеют отдельную двухбелковую структуру, отличаясь от первого и третьего классов со сложным строением и АТФ-зависимостью, что позволяет использовать их для генной инженерии. Фермент второго класса состоит из двух действующих частиц: рестриктирующей эндонуклеазы, модифицирующей метилазы, которые действуют только вместе с ионами магния.

Благодаря достижениям молекулярной биохимии, ученые смогли выделить более пятисот специфичных рестриктаз второго класса.

Но как выяснилось по ходу исследований, некоторые из них действуют на одинаковые последовательности нуклеотидов. Такие ферменты получили название — изошизомеры.

Истинные изошизомеры делят сайт ДНК по одной точке, а гетерошизомеры, выбирая одинаковый сайт, осуществляют рестрикцию в разных его местах.

Как уже было указано, рестриктазы чаще выделяют последовательность из 4 или 6 азотистых оснований, а потому, в зависимости от количества, делятся на мелко- и крупнощемящие.

Механизм действия

Эндогенная рестриктаза распознает определенную последовательность ДНК — сайт узнавания. В большинстве случаев он является палиндромом, то есть порядок расположения нуклеотидов одинаков при чтении справа налево и слева направо. Например, 3′-AGATCT-5′ или 5′-TCTAGA-3′.

Фермент прочно связывается с узнанным рядом азотистых оснований, а затем при движении цепочек молекулы «находит» сайт разрезания.

Рестрикция возможна с образованием тупых (blunt) и липких (sticky) концов. Тупые концы образуются, если рестриктаза делит цепочки ДНК друг напротив друга. А липкие концы характеризуются образованием коротких и длинных хвостов (3′-, 5′-концов) из-за несимметричного разрезания палиндромов. Липкие концы самокомплементарны, то есть способны восстановить структуру при соединении.

Необходимость изучения механизмов рестрикции

Изучение процессов рестрикции существенно упростило исследовательскую деятельность, так как с ее помощью стало возможным разделение единицы генетического материала на небольшие части.
С помощью физических методов (электрофорез с агарозой) фрагменты можно разделить по размеру, а затем изучить каждый в отдельности, построив рестрикционные карты.

Практическое применение в медицине и генетике

Если несколько упростить и схематично отобразить алгоритм действий генной инженерии, то мы получим следующее: сначала необходимо выделить исходную информацию из исследуемого материала, затем разделить её на части, последовательности, потом объединить, синтезировать различные фрагменты воедино для возникновения новой структуры генетической информации, обладающей заданными характеристиками, и в последующем ввести новый материал другому организму.

Расщепление ДНК (рестрикция) является основой генетической инженерии и находит своё применение во множестве ежедневно проводимых исследований.

На основе нуклеотидных последовательностей, полученных при разделении цепочек различных молекул, создаются искусственные рекомбинантные ДНК, которые находят широкое применение во многих отраслях человеческой жизни.

Значительное количество научных работ посвящены исследованию возможности лечения таких непобедимых на сегодня заболеваний как ВИЧ-инфекция, опухоли и пр.

Например, путём присоединения к генам, кодирующим белки-рецепторы заражённых вирусом клеток, другого гена, который способствует синтезу растительного яда, нарушается процесс биосинтеза белка в цитоплазме, что ведет к их гибели. В перспективе могут быть найдены подходы к лечению множества наследственных врожденных и приобретённых заболеваний, причем на самом раннем этапе — на молекулярном, субмолекулярном уровнях.

Известны исследования в области фармацевтики, улучшающие характеристики производимых лекарств и способы их доставки к клеткам, тканям организма.

Сделала крупные шаги вперед трансплантология, позволяя выращивать донорские органы в различных животных или даже просто в пробирках с питательными средами, при этом исключая энзимную несовместимость благодаря генной модификации.

Перспективы развития

Генетическая инженерия предоставляет огромные возможности в вопросах улучшения существующих организмов или создания новых, способных существенно поднять продуктивность биотехнологических процессов, приумножить их хозяйственную ценность для человека.

Генетически модифицированные продукты прочно обосновались в нашей жизни, и, несмотря на некоторые скептические мнения экспертов, большинство учёных склоняется к выводу, что за ГМО стоит будущее в вопросах продуктового обеспечения человечества.

В последующем ученым могут открыться новые горизонты для исследований метаболизма, замедления процессов старения, разработки и использования новейших бионанотехнологий применительно к человеческому организму.

Интересный факт о рестрикции

Ученый Ренди Люис (к слову, большой поклонник Человека-паука) провел рестрикцию генома паука, выделив фрагменты, отвечающие за производство каркасной паутины (самой прочной), а затем встроил их в гены выработки молока у коз. Результатом стало появление козлят, вырабатывающих молоко и паутину.

Источник: https://testdnk.pro/informacia/restrikciya-dnk.html

Ферменты-рестриктазы и рестрикция днк

РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК

В ходе эволюции бактерии развили способность синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали частью клеточной (бактериальной) системы рестрикции-модификации. У бактерий системы рестрикции-модификации являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК.

В отличие от высших организмов, у которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых они обитают) происходит внутриклеточно, т. е. тогда, когда чужеродная ДНК проникает в цитоплазму бактерий.

С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность «метить» собственную ДНК метилирующими основаниями на определенных последовательностях. По этой причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метальных групп на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными бактериальными рестриктазами, а затем деградируется бактериальными экзонуклеазами до нуклео-тидов.

Можно сказать, что таким образом бактерии защищают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты).

Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г- Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I.

Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инженерии.

Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.

Действие системы рестрикции-модификации «рационализуется» так называемыми палиндромными (распознающими последовательностями) азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК.

Палиндромные последовательности — это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар.

Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5′- к 3′-концу на верхней и 3′- к о’-концу на нижней цепи, а именно:

Палиндромы могут быть любых размеров, но большинство тех палиндромов, которые используют в качестве сайтов узнавания рестриктазами, состоят из 4, 5, 6 и реже 8 оснований.

Рестриктазы — это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.

Замечательной особенностью рестриктаа является то, что они продуцируют разрезы молекул на несколько фрагментов (рестрик-тов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов (рис. 224), т. к. они способны к самокомплементарности.

Рассмотрим результаты рестрикции на примере одной из наиболее известных рестриктаз Eco RI из системы рестрикция—модификация Е. coli. Вместо того, чтобы плавить ДНК в центре па-линдромной последовательности узнавания, этот фермент плавит ДНК за пределами центра и продуцирует 4 самокомплементарных («липких») конца, состоящих из разного количества нуклео-тидов, а именно:

Эти «липкие» концы в генно-инженерных опытах полезны по той причине, что они могут быть воссоединены комплементарно при низких температурах, что позволяет эффективное смыкание ДНК-фрагментов.

Сайты распознания и сайты плавления в случае других рестриктаз имеют другое содержание, а именно:

Вслед за рестрикцией ДНК из рестрикционной смеси выделяют рестрикционные ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты), которые необходимы затем для объединения с вектором.

Для выделения ДНК-рестриктов прибегают к электрофорезу, поскольку с помощью этого метода рестрикцированную ДНК очень легко фракционировать благодаря размерам фрагментов-рестриктов и благодаря константным отношениям электрический заряд-масса.

Фрагменты в электрическом поле мигрируют в ходе электрофореза при частоте, зависимой от их размеров (массы). Чем больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее он мигрирует в электрическом поле.

Материалом, в котором проводят электрофорез, являются незаряжающиеся агаро-за и полиакриламид. Для опознания фрагментов используют эти-дий бромид, который красит фрагменты, что ведет к их более легкому обнаружению (рис. 225).

Результативность электрофореза очень высока, поскольку с его помощью могут быть разделены фрагменты, размеры которых составляют от 2 до 50 000 оснований.

После электрофореза фрагменты из агарозы выделяют с помощью разных методов.

На основании результатов сравнения размеров рестриктов одной и той же ДНК, полученных с помощью разных рестриктаз, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктаз (см. § 107).

В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестриктов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК локусов тех или иных генов.

Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции.

Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть секвени-рованию, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы сек-венирования.

Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты.

Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов in vitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически.

Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн- и Саузерн-блоттинги.

Генеические векторы

Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами.

Последние должны обладать, как минимум, двумя свойствами. Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях. Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т. е.

обладать маркером, на который можно вести контрселекцию клеток, содержащих вектор вместе с клонируемым геном (рекомбинантные молекулы ДНК). Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги.

Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.

Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно.

Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции.

Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома.

Например, плазмидный вектор pBR 322, который содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов-рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco R I, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I (рис. 226).

Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами.

Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате ин-фицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК.

Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага лямбда.

Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК.

Если клонирование генов проводят, используя клетки млекопитающих или растений, то требования к векторам те же, что и в случае клонирования в бактериальных клетках.

:

Источник: http://dnatree.ru/fermenty-restriktazy-i-restrikcija-dnk/

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.

    ×
    Рекомендуем посмотреть