РЕСТРИКТАЗЫ

Эндонуклеазы рестрикции

Введение
• 1 Классификация
• 2 Изошизомеры
  • 2.1 Гетерошизомеры (неошизомеры)
  • 2.2 Изокаудомеры
• 3 Значение

Примечания

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием)[1].

1. Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными[2].:

• Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удаленной областью ДНК или передвигается вдоль нити ДНК).
• Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии.
• Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции.[3] Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.[4][5][6]

2. Изошизомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах.

Например, изошизомерами являются рестриктазы Sph I (CGTACG) и Bbu I (CGTACG).

Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

2.1. Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров. Например, рестриктазы Sma I (GGGCCC) и Xma I (GGGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

2.2. Изокаудомеры

Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

3. Значение

В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром. Все рестриктазы II типа — Mg2+-зависимы.

Рестриктазы — часть сложной системы рестрикции-модификации, используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активности ДНК в клетке.

Открытие рестриктаз в 1970-х годах вместе с разработкой способов секвенирования ДНК послужило основным толчком для развития генетической инженерии.

В настоящее время рестриктазы с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.

Примечания

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. — 2. — Москва: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с. — 10000 экз. — ISBN 5030019855
2. Айала Ф. Д. Современная генетика. 1987.
3. Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007).

   Рестриктазы — это что? Определение и классификация рестриктаз

   

   Рестриктазы — это особые ферменты, способные разрезать цепочки ДНК в строго определенных местах. Именно в специфичности действия заключается главное отличие данной группы белков от других видов эндонуклеаз. Благодаря этому уникальному свойству ферменты рестрикции нашли широкое применение в генной инженерии.

   Рестриктазы — это уникальные ферменты бактерий. Впервые эти белки были выделены в 1968 году из штаммов Esherihia colli. Дальнейшие исследования выявили присутствие эндонуклеаз рестрикции в одноклеточной водоросли Chlorella, а также в нескольких культурах дрожжей Sachoromyces и Pichia. В клетках других эукариотов рестриктазы пока не обнаружены.

   Общая характеристика

   Рестриктазы — ферменты, относящиеся к группе гидролаз, поскольку катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи между нуклеотидами в цепочке ДНК. Место, в котором происходит разрезание, называется сайтом рестрикции. Последний может находиться как внутри опознаваемой последовательности, так и на расстоянии от нее.

   Специфичный для рестриктазы участок распознавания обычно состоит из 4-8 нуклеотидов. Так как азотистые основания обращены внутрь двойной спирали, фермент находит нужную последовательность за счет взаимодействия с большой бороздкой ДНК.

   Каждая рестриктаза имеет свой сайт распознавания и может функционировать только после связывания с ним.

   Биологическая роль

   Бактерии рестриктазы — это важнейший инструмент защиты клетки от бактериофагов. Основная задача ферментов данной группы состоит в разрезании проникшего в клетку чужеродного генетического материала. Фрагментирование нуклеиновой кислоты препятствует ее репликации, а значит, и размножению вируса.

   Последовательности, к которым специфичны рестриктазы, с определенной периодичностью встречаются в геноме самой бактерии и потому подвергаются метилированию, которое не позволяет рестриктазам распознать свои мишени. Этот процесс осуществляется ферментами метилазами.

   Механизм, направленный на разрезание чужеродной ДНК и защищающий от нуклеазной активности собственную, называется системой рестрикции-модификации. Некоторые типы рестриктаз способны проявлять как эндонуклеазную, так и метилазную активность.

   На настоящий момент известно более 1000 бактериальных рестриктаз. Очень часто они рассматриваются не как отдельные ферменты, а в комплексе систем рестрикции-модификации.

   Особенности действия рестриктаз

   После связывания с последовательностью распознавания эндонуклеаза рестрикции поочередно расщепляются цепи ДНК. При этом могут образовываться два варианта концов:

   • Липкие — одноцепочечные комплементарные друг другу последовательности, которые легко могут «сшиться» обратно. Формируются при ступенчатой траектории разрезания, когда точки расщепления двух цепей не совпадают;
   • Тупые — одноцепочечные участки в месте разрыва ДНК не образуются, точки разрезания цепей находятся напротив друг друга.

   Для осуществления эндонуклеазной активности рестриктазам требуется кофактор в виде Mg2+. Расположившись на месте разрыва этот ион вмешивается в конфигурацию ДНК, что способствует последующему расщеплению.

   Классификация рестриктаз

   По строению и механизму действия все рестриктазы разделяют на 2 класса. К первому относятся ферменты, обладающие исключительно рестрикционной активностью, а метилирование осуществляется другим белком с аналогичной субстратной специфичностью.

   Рестриктазы класса II представляют собой мультиферментные комплексы, способные как разрезать, так и модифицировать ДНК. Эти белки состоят из 3 функциональных субъединиц:

   • сайт-узнающей;
   • метилирующей;
   • рестриктирующей.

   Есть и другая разновидность рестриктаз того же класса, для которой характерна структура из двух субъединиц. Такие ферменты называют бифункциональными.

   Метилазная и эндонуклеазная активности у разных рестриктаз могут осуществляться одновременно, либо исключать друг друга. Эффект действия таких ферментов зависит от условий реакции.

   В пределах двух классов выделят три типа рестиктаз (I, II и III), которые различаются по следующим характеристикам:

   • структурная организация;
   • выполняемые функции;
   • особенности субстратной специфичности;
   • потребность в кофакторах;
   • расположение сайта рестрикции относительно участка распознавания;
   • обратимость реакции рестрикционного гидролиза;
   • потребность в энергии АТФ;
   • механизм действия.

   Тип II соответствует первому классу эндонуклеаз рестрикции, а первый и третий типы являются разновидностями класса II.

   Характеристика эндонуклеаз рестрикции

   Тип	I	II	III
   Структура	3 разные субъединицы	Одна или несколько идентичных субъединиц	2 различные субъединицы
   Функции	Рестрикция и метилирование	Рестрикция	Рестрикция и метилирование
   Реакции гидролиза и метилирования	Взаимоисключающие	Отдельные реакции (для каждой свой фермент)	Возможно одновременное проявление
   Расположение сайта разрезания	Случайное, не менее 1000 пар нуклеотидов от распознаваемой последовательности	Внутри распознаваемой последовательности	На расстоянии 24-26 нуклеотидных пар от последовательности распознавания
   Кофакторы рестрикции	S-анедозил-L-метионин (Адо-мет), Mg2+, АТФ	Mg2+	Mg2+, АТФ (необходимы); Адо-мет (необязателен, стимулирует реакцию)
   Кофакторы метилирования	Адо-мет (необходим); Mg2+ и АТФ (стимулируют реакцию)	нет метилирования	Адо-мет (необходим); Mg2+ и АТФ (стимулируют реакцию)
   Энзиматическая обратимость рестриктазной реакции	Есть	Нет	Нет
   Последовательность распознавания	Прерывистая, вращательная симметрия отсутствует	Короткие последовательности, обладающие вращательной симметрией второго порядка	Последовательность имеет некоторые элементы симметрии либо полностью лишена последней
   Транслокация ДНК перед разрезанием	Есть	Нет	Нет

   Кроме трех основных разновидностей рестриктаз выделяют еще два типа:

   • IIS — отличается от типа II тем, что система рестрикции-модификации кодируется не двумя, а тремя генами, а сайт разрезания находится вне последовательности распознавания (на фиксированном расстоянии);
   • Mcr/Mrr — содержит несколько разных субъединиц при отсутствии модификационной активности, для работы требуется ГТФ, расщепляет ДНК с метилированными аденином и цитозином.

   Рестриктазы первого и третьего типов характеризуются неполным гидролизом цепей ДНК и потому практически не используются в технологиях генной инженерии.

   Номенклатура

   Обычно в названии рестриктазы содержится информация о том, из какого микроорганизма она была выделена. При этом, информация указывается в следующем порядке:

   • род и вид;
   • штамм;
   • номер фермента (если данный микроорганизм содержит несколько систем рестрикции-модификации).

   Иногда в название включают информацию о локализации генов, кодирующих рестриктазу.

   Номенклатура для рестрикционных ферментов была разработана Смиттом и Натансом. Она базируется на следующих принципах:

   • Первая латинская буква обозначает род, а две последующие — вид микроорганизма.
   • Далее латинской буковой указывается штамм или внехромосомный элемент, кодирующий рестриктазу.
   • В конце римской цифрой обозначается номер фермента.

   Таким образом, вторая по счету рестриктаза, выделенная из штамма d бактерии Haemophilus influenzae будет обозначаться HindII.

   Существует еще одна классификация ферментов рестрикции, основывающаяся на их специфичности к субстрату.

   Изошизомеры — это рестриктазы с разным происхождением, но одинаковой субстратной специфичностью. Такие рестриктазы могут быть выделены даже из отдаленных таксонов бактерий. Открытие изошизомеров опровергло предположение о строгой таксоноспецифичности рестриктаз, утверждавшее, что участки распознавания для этих ферментов у разных видов микроорганизмов уникальны.

   Неошизомеры

   Неошизомерами называются рестриктазы, имеющие общий участок распознавания, но разные сайты рестрикции. Например, для ферментов SmaI и XmaI специфична последовательность CCCGGG, но в одном случае разрезание проходит посередине (CCC/GGG), а в другом расщепляется связь между первым и вторым нуклеотидами (C/CCGGG).

   Изокаудомеры

   К изокаудомерам относят ферменты рестрикции с разной субстратной специфичностью, которые формируют одинаковые концы. Предполагается, что белки данной группы не являются родственными.

   Применение рестриктаз

   Рестриктазы являются одним из главных молекулярных инструментов, используемых в технологии рекомбинантных ДНК. Благодаря этим ферментам стало возможным вырезать из геномов различных организмов определенные фрагменты или гены, а затем сшивать их с помощью лигаз.

   Особенно удобно использование в генной инженерии рестриктаз, образующих одинаковые липкие концы. Такие фрагменты ДНК легко соединяются по принципу комплементарности

   No related posts.